Линия управления
Прививка животного с антитела (антитела) из разных видов может генерировать вторичные антитела. Например, инъекция антител мыши в животное, кроме мыши, поднимает антимышечные вторичные антитела. Коза, ослик и кролик являются наиболее распространенными видами для производства вторичных антител.
Наиболее распространенными типами вторичных антител являются те, которые генерируются против общей популяции иммуноглобулинов из мишени.
Например, иммунизация козы с очищенной мышкой IgG будет генерировать козы анти-мышей IgG антитела, которые будут связываться со всеми классами, тяжелые и легкие цепи (H L) И фрагменты мыши IgG, а также любые другие молекулы, разделяющие строго сохраненные области (e.g., igM имеет те же легкие цепи kappa, что и IgG).
В отличие от этого, иммунизация козла только с помощью мыши IgG1 антитела генерирует антитела, специфические для мышей IgG1 антитела и молекулы, разделяющие строго сохраненные области.
Из-за высокой степени сохранности в структуре многих областей иммуноглобулина, вторичные антитела класса должны быть очищены и перекрестно адсорбированы для достижения минимальной перекрестной реакции с другими иммуноглобулинами.
Иммобилизованная мышь IgG1 Антитела могут очистить все козьи антитела, которые связываются с мышью IgG1, используя приведенный выше пример. Прохождение через колонку хроматографии (ы), содержащую мышь IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM и т. Д., еще больше улучшит эти анти-мышечные антитела IgG1, чтобы удалить любые кросс-реакционные антитела с non-IgG1 изотипами.
Кроме того, прохождение через колонны, содержащие иммобилизированные сывороточные белки других видов, кроме тех, которые используются для иммунизации хоста, может дополнительно очищать вторичные антитела. Этот метод перекрестной адсорбции (часто называемый «высоко-адсорбированным») это дополнительный шаг очистки, рекомендованный для применения при использовании первичных антител от нескольких видов и когда иммуноглобулинов или других сывороточных белков могут присутствовать в пробах.
Продукты линии управления
| Антитела | Применение |
| Кролик IgG | Для иммунодиагностики: ELISA, LFA, CLIA |
| Мышь IgG | |
| Мышь IgM | |
| Куриный IgY | |
| Козья Анти мышь IgG | |
| Коза анти кролик IgG | |
| Коза против курицы IgY | |
| Мышь против человеческого IgG |
Контроль Isotype
Основная цель контроля isotype заключается в том, чтобы определить, что Связывание первичных антител является специфическим, а не неспецифическим рецепторам Fc или взаимодействиям с другими белками. Он также может связывать антитела на конкурсной основе и выполнять те же функции, что и антитела, блокирующие функцию.
Контроль isotype должен полностью соответствовать источнику первичного антитела, ввода Ig и маркировки.
Нормальная сыворотка может использоваться в качестве отрицательного контроля при иммунофлуоресцентной маркировке, если первичное антитела является поликлональным. Из-за различных источников флюоресцентно маркированных МАБ, немаркированные мабы из того же источника должны использоваться в качестве элементов управления isotype для регулировки фонового окрашивания. Например: например, если основным антитела является мышка против крыс CD11b и клонирование OX-42 очищенного IgG, его изотипом является мышь IgG2a, таким образом, очищенная мышь IgG2a может использоваться как isotype control или OX-42.
Контроль Isotype: относится к тому же субклассу иммуноглобулина, что и Моаб, у неиммунизированных мышей, были в основном рассмотрены такие факторы, как клеточная автофлуоресценция, FC рецептор-опосредованная антитела и неспецифическая вязка. Если используется прямое иммунофлуоресцентное окрашивание, контроль isotype также должен быть маркирован флуоресцентными пигментами, такими как IgG1 FITC, IgG2a, PE и т. д. Кроме того, isotype control и Moab-отмечены концентрацией фторхрома и F:P Соотношение (отношение маркированных фторхрома к молекулам иммуноглобулина) должно быть таким же, как и лучшее, Что имеет важное значение для точной настройки отрицательных и положительных моментов. Не используйте isotype контроль, который не соответствует MoAb, предпочтительно продукт, приготовленный той же Лабораторией и с использованием того же процесса или метода (например, того же бренда).
Isotype контроль потока цитометрии
Fab фрагмент антитела может привязаться к поверхности клетки с низким сродством и неспецифичностью, особенно когда клетка мертва или клеточная мембрана повреждена; эта неспецифическая вязка будет более очевидной. Поэтому контроль isotype часто используется в экспериментах для определения фоновых уровней флуоресценции.
Контроль isotype был классическим отрицательным эталоном в потоковой цитометрии. Для достижения такой же перекрестной реактивности между контролем изотипа и антитела, должны быть последовательны изотип, виды, фтор, фтор, соотношение белка, концентрации и другие показатели.
Меры предосторожности:
1. Если выражение антигена является бимодальным распределением, а отрицательные и положительные пики разделены, экспериментальные результаты могут понять через бимодальное распределение.
2. Если культивированные клетки должны быть обнаружены, то установка контроля isotype в это время может получить только некоторую информацию, отражающую способность адгезии клеток, И трудно получить информацию, отражающую ее неспецифическую флуоресценцию. Поэтому Настройка контроля isotype для обнаружения культивированных клеток не является идеальной.
3. Если различные флуоресцентные вещества используются в эксперименте одновременно, во время анализа обнаруживается, что флуоресцентная утечка оказывает значительное влияние на результаты, И фоновая Флуоресценция не является очевидной, не подходит для установки контроля isotype в это время. Хороший выбор. (Контроль FMO-это клетки одного вида, запятнаны всеми другими флюоресцинами с одним флуоресцентным удалением, так что утечка различных флуоресцеинов на немаркированный канал может быть проявлена, и ворота могут быть размещены на месте, так что, является необходимым контролем для стробирования. И контроль FMO имеет большое значение только тогда, когда необходимо точно различать положительные и отрицательные. Управление FMO в настоящее время широко используется в многоцветных экспериментах и необходимо для многоцветных экспериментов.)
4. При использовании управления isotype обнаруживается, что неспецифический уровень привязки очень высокий, что может быть связано с связыванием неспецифического Fc конца к ячейке, что приводит к неспецифическому сигналу, поэтому обратите внимание на блокировку Fc.
5. Необходимо понимать, что контроль isotype-это только ссылка, чтобы помочь нам отфильтровать некоторые факторы, которые влияют на эксперимент, но мы не можем определить положительные и отрицательные точки отключения или установить ворота на основе этого. Мы должны знать, что контроль isotype может отражать только фоновую флуоресценцию неспецифического переплета, а фоновая флуоресценция также вызвана другими факторами, такими как автофлуоресценция, высокая компенсация, антитела, методы маркировки, инструменты, другие реагенты или анализ данных и другие факторы повлияют на фоновую флуоресценцию.
6. Необходимо титрировать целевую антитела, чтобы уменьшить фоновую флуоресценцию неспецифического связывания, и это не подходит для установки контроля isotype. Из-за чрезмерного количества антител произойдет отрицательное пиковое смещение и расширение базы.
7. Если в эксперименте обнаружены сигнальные сигналы клеток и цитокины, следует установить контроль FMO и отрицательный биологический контроль, уделяя особое внимание нестимулированным клеткам или клеткам, обработанным ингибиторами фосфорилации.
8. Для удаления мертвых клеток краситель добавляется в многоцветную схему. Поскольку Неспецифическое окрашивание клеток является экстремальным, если оно не удаляется, это приведет к более высокой неспецифической вязке и повлияет на эксперимент.
9. Он доступен для установки других элементов управления, кроме контроля isotype в различных ситуациях. Например, для неокрашенных ячеек, определите отрицательные элементы управления для фона и автофлуоресценции, установите напряжение PMT;
Для полностью окрашенных клеток, определите некоторые события вне оси, установите напряжение PMT; Для одиночных витражных клеток/микросфер, отрегулируйте компенсацию; Нестимулированные или необработанные образцы, экспериментальный отрицательный контроль; положительные клетки (стимулируются или лечатся с помощью определенных лекарственных средств), положительный практический контроль.
